糖原磷酸化酶 a（Glycogen phosphorylase a，GPa）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶，使糖原分子從非還原端逐個(gè)斷開α-1，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放 1-磷酸葡萄糖，直至臨近糖原分子α-1，6-糖苷鍵分支點(diǎn)前 4 個(gè)葡萄糖基處。GP 分為有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）和無(wú)活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）兩種形式。糖原的分解主要在 GPa 的催化下進(jìn)行。

測(cè)定原理：

未添加激活劑時(shí)，GPa 催化糖原和無(wú)機(jī)磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化 NADP 還原生成NADPH，在 340nm 下測(cè)定NADPH 上升速率，即可反映GPa 活性。

糖原磷酸化酶a試劑盒   糖原系列-常備現(xiàn)貨

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、工作液的配制：臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑三的配制：臨用前在試劑三瓶中加入 2.5ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、試劑四的配制：臨用前在試劑四瓶中加入 2.5ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

5、將工作液、試劑三和試劑四置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘；

6、在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 樣本、50μl 試劑三、50μl 試劑四、50μl 蒸餾水和 800μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處 5min 后的A1 和 10min 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

GPa 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GPa（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=643×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

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