NADP-蘋果酸酶（Malic enzyme ，NADP-ME）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物 ME 活性測(cè)定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測(cè)定原理：

NADP-ME 催化NADP+還原成 NADPH，在 340nm 下測(cè)定NADPH 增加速率。

NADP-蘋果酸酶試劑盒 輔酶Ⅱ系列

組成：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存； 臨用前加入 20ml 試劑一充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 2.5ml 蒸餾水充分振蕩，溶解待用，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。14000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 170μl 試劑二，混勻，30℃孵育 5min，加入 20μl 試劑三，混勻后立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

NADP-ME 活性計(jì)算：

（a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T = 3215×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T = 6431×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T =12.86×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol/cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

NADP-蘋果酸酶試劑盒 輔酶Ⅱ系列