果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP 轉(zhuǎn)化為果糖-1,6 二磷酸和ADP，是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

測(cè)定原理：

PFK 催化果糖-6-磷酸和ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化 NADH 氧化生成NAD⁺，在 340nm 下測(cè)定NADH 下降速率，即可反映PFK 活性。

果糖-6-磷酸激酶試劑盒 糖酵解系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存，臨用前加入 2.8ml 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20 度保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1 支，4℃保存，臨用前加入 260μl 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20 度保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：液體 16μl×1 支，4℃保存，臨用前加入 260μl 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20 度保存，禁止反復(fù)凍融；

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟和加樣表：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液（可測(cè) 25 個(gè)樣）的配制：取 19ml 試劑一和 1.26ml 試劑二充分混勻；用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融；

3、將工作液置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。

4、加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中，立即混勻，加試劑四的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄在 340 nm 波長(zhǎng)下20 秒時(shí)的初始吸光度A1 和 10 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：不同勻漿組織中 PFK 活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做 1-2 只預(yù)試，若ΔA>0.5，則說(shuō)明活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時(shí)間至 2min 或5min，使ΔA<0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。

PFK 活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）PFK 活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

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PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=450×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PFK 活力計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=450×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 轉(zhuǎn)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

PFK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.225×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 ml；

V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000 萬(wàn)。

果糖-6-磷酸激酶試劑盒 糖酵解系列