抗壞血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

AAO 是定位于植物細(xì)胞壁的糖蛋白，屬“藍(lán)銅氧化酶"家族。細(xì)胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO 與細(xì)胞壁的代謝和生長(zhǎng)有著密切的聯(lián)系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過(guò)質(zhì)膜上的細(xì)胞色素b 還原，該過(guò)程中電子的跨膜運(yùn)輸能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

測(cè)定原理：

AAO 可直接氧化AsA，通過(guò)測(cè)定AsA 的氧化量，可計(jì)算得 AAO 活力。

抗壞血酸氧化酶活性測(cè)定試劑盒-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 2ml 蒸餾水充分溶解。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

AAO 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 265 nm。

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μl 上清液、170μl 預(yù)熱的試劑二和 10μl 試劑三，迅速混勻后在265nm 測(cè)定 10s 和 130s 光吸收A1 和A2，△A =A1-A2。

AAO 活性計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AAO 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

= 92.4×△A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AAO 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92.4×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μl=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積

（ml），20μl=0.02 ml；V 樣總：提取液體積，1ml； T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AAO 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T

=184.8×△A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AAO 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V 反總×10⁹÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 184.8×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光徑（cm），0.5 cm； V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μl=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（ml），20μl=0.02 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；

T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

注意事項(xiàng):

配制好的試劑放在 4℃保存，三天內(nèi)使用完。

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