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硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxin reductase, TrxR）試劑盒說明書
微量法 100T/96S
TrxR 是一種NADPH 依賴的包含FAD 結構域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及 NADPH 共同構成了硫氧還蛋白系統。TrxR 與GR 活性類似，催化 GSSG 還原生成GSH，是谷胱gan肽氧化還原循環(huán)關鍵酶之一。
TrxR 催化NADPH 還原DTNB 生成TNB 和NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，通過測定 412nm波長處TNB 的增加速率，即可計算TrxR 活性。
產品名稱 | BV6010-100T/96S | Storage |
試劑一：液體 | 120ml | 4℃ |
試劑二：液體 | 2ml | 4℃避光 |
試劑三：粉劑 | 1 管 | 4℃ |
說明書 | 一份 | |
試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入 2ml 蒸餾水溶解。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
低溫離心機、可調節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸餾水。
1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調節(jié)波長到 412nm，用蒸餾水調零。
2. 試劑一在 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）預熱 30min。
3. 空白管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μl 試劑二，20μl 試劑三，160μl 試劑一，迅速混勻后于412 nm 測定 10 s 和 310 s 吸光度，記為 A1 和A2。△A 空白管=A2-A1。
4. 測定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，加入 20μl 試劑二，20μl 試劑三，140μl 試劑一，20μl 上清液，迅速混勻后于 412 nm 測定 10 s 和 310 s 吸光度，記為A3 和A4。△A 測定管=A4-A3。
注意：空白管只需測定一次。
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T
= 147×（△A 測定管-△A 空白管）÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 147×（△A 測定管-△A 空白管）÷W
（3） 按細胞數量計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 104 個細胞每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min/104 cell）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 147×（△A 測定管-△A 空白管）÷ 細胞數量
（4） 按液體體積計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min /ml）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T
= 147×（△A 測定管-△A 空白管）
ε：TNB 在 412nm 處的微摩爾消光系數，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應體系總體積（L），200μl=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/ml），需要另外測定；W ：樣品質量；V 樣：加入反應體系中上清液體積（ml），20μl=0.02 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應時間（min），5 min。
b.使用 96 孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T
= 294×（△A 測定管-△A 空白管）÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每克樣本每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 294×（△A 測定管-△A 空白管）÷W
（3） 按細胞數量計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每 104 個細胞每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min/104 cell）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 294×（△A 測定管-△A 空白管）÷ 細胞數量
（4） 按液體體積計算
活性單位定義：在 25℃或者 37℃中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol DTNB 還原為 1 個酶活單位。
TrxR（nmol/min /ml）=（△A 測定管-△A 空白管）÷ε÷d×V 反總÷V 樣÷T
= 294×（△A 測定管-△A 空白管）
ε：TNB 在 412nm 處的微摩爾消光系數，0.0136 L/μ mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應體系總體積（L），200μl=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/ml），需要另外測定；W ：樣品質量；V 樣：加入反應體系中上清液體積（ml），20μl=0.02 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應時間（min）， 5 min。
1. 測定前須先取 1～2 個樣做預實驗，哺乳動物組織及血液制品TrxR 活力測定時，一般須用蒸餾水稀釋5 倍左右；測定過程操作須迅速。
2. 試劑二和試劑三配制好后 3 天內使用完。
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