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γ-谷氨酰半胱an酸連接酶（GCL）說明書
微量法 100T/96S
GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL 基因表達受多種因素調節，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL 活性高低對GSH 含量和GSH/GSSG 比值有重要影響。
在ATP 和Mg2+存在下，GCL 催化谷an酸和半胱an酸合成γ-谷氨酰半胱an酸；同時 ATP 去磷酸化產生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出 GCL 活性。
產品名稱 | BV6012-100T/96S | Storage |
試劑一：液體 | 105ml | 4℃ |
試劑二：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑三：粉劑 | 1 管 | 4℃ |
試劑四：液體 | 7ml | 室溫 |
試劑五：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
說明書 | 一份 | |
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 6 ml 蒸餾水充分震蕩溶解。
試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入蒸餾水 1.5 ml 充分震蕩溶解。
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 12 ml 蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入 400µl 濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。
具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準
冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、濃硫酸和蒸餾水。
1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
1. 分光光度計/酶標儀預熱 30min，調節波長到 660nm，蒸餾水調零。
2. 空白管：取 1.5mlEp 管，依次加入試劑一 48µl、試劑二 52µl、試劑三 12µl 和蒸餾水 24µl，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應 15 min；再加入試劑四 60µl，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心 10 min，取上清 100µl，加入試劑五 100µl，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測定 660nm 處光吸收，記為A空白管。
3. 測定管：取 1.5mlEp 管，依次加入試劑一 48µl、試劑二 52µl、試劑三 12µl 和上清液 24µl，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應 15 min；再加入試劑四 60µl，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心 10 min，取上清 100µl，加入試劑五 100µl，混勻后蓋緊，45℃水浴 10min，冷卻后測定 660nm 處光吸收，記為A測定管。
注意：空白管只需要測定一次。
標準曲線：y=0.1427x，R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）=[（A 測定管-A 空白管）÷0.1427×V 反總]÷(Cpr×V 樣)÷T
=3.815×（A 測定管-A 空白管）÷Cpr
（2） 按樣本質量計算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A 測定管-A 空白管）÷0.1427×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 3.815×（A 測定管-A 空白管）÷W
（3） 按細胞數量計算
活性單位定義：37℃下，每 104 個細胞每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A 測定管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反總]÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 3.815×（A 測定管-A 空白管）÷細胞數量
（4） 按照液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /ml）= [（A 測定管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反總]÷V 樣÷T
= 3.815×（A 測定管-A 空白管）
0.1427：回歸方程系數；V 反總：反應總體積（ml）196 µl=0.196 ml；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/ml； V樣：加入反應體系中上清液體積，24µl =2.4×10-2 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；W：樣本質量，g；T：反應時間：15min。
b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下標準曲線：y=0.07135x，R2=0.9987
（(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /mg prot）= [（A 測定管-A 空白管）÷0.07135×V 反總]÷(Cpr×V 樣)÷T
=7.63×（A 測定管-A 空白管）÷Cpr
（2） 按樣本質量計算
活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A 測定管-A 空白管）÷0.07135×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
= 7.63×（A 測定管-A 空白管）÷W
（3） 按細胞數量計算
活性單位定義：37℃下，每 104 個細胞每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A 測定管-A 空白管）÷0.07135×V 反總]÷(細胞數量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 7.63×（A 測定管-A 空白管）÷細胞數量
（4） 按照液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產生 1μg 無機磷的GCL 酶活量為 1 個酶活單位。
GCL（μg/min /ml）= [（A 測定管-A 空白管）÷0.07135×V 反總]÷V 樣÷T
=7.63×（A 測定管-A 空白管）
0.07135：回歸方程系數；V 反總：反應總體積（ml）196 µl=0.196 ml；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/ml； V 樣：加入反應體系中上清液體積，24µl =2.4×10-2 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應時間：15min。
1、樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復凍融。
2、所有試劑配制完后，除表明 4℃保存外，請于 1 天內用完。
3、實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質，注意不要濺到皮膚上或眼睛內。
4、測定吸光值時請于水浴后 10～40 分鐘內測完。
5、樣本測定前先取 1-2 個樣做預實驗，如吸光值太高，應先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數，使得吸光值在標準曲線范圍內，哺乳動物組織和血液一般稀釋 3～5 倍。
6、試劑三配制過程中，可能會產生黑色固體，其不影響結果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。
7、細胞中GCL 活性測定時，細胞數目須在 300 萬-500 萬之間，細胞中 GCL 的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞；
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